透射、宽场荧光、共聚焦显微技术概览

随着显微系统的发展，显微技术也得到了同步发展。显微镜中的第一个技术是基于 透射光显微镜。对于现代显微镜学家来说非常有价值的其他技术是 宽场荧光显微镜 和 共焦显微镜。此外，通过光子重新分配进行图像重建和治疗是成像采集后治疗的重要因素。因此， 反卷积 软件已成为采集后图像处理的重要工具。

1. 透射光显微镜（Transmitted Light Microscope)
在透射光显微镜中，光穿过样品，因此产生了术语“透射光显微镜”。
最简单的技术是 明场。该技术可用于对较厚的组织或用组织学染料（例如苏木精和曙红染色剂）染色的组织进行成像，以提供图像的对比度和细节。然而，明场对于较薄且未染色的样品成像并不理想。问题在于细胞内部的结构无法产生足够的对比度以供我们的眼睛看到。因此，透射光显微镜技术的其他技术也得到了发展。
相差显微镜 在光路中使用相位板环，可在样品内的结构之间产生更高的相位差，从而转化为更高对比度的图像。相差是透射光显微镜的一大改进，可以观察薄的未染色样品的结构。然而，这种技术的问题是产生的明亮光晕（“相位光晕”）会隐藏细节。
另一种可提供高对比度和高分辨率的透射光显微镜技术是 DIC。 DIC 代表 微分干涉对比；它具有复杂且昂贵的光学器件。 DIC 依赖于两个偏振器的使用：一个放置在光照射到样品之前，另一个放置在样品发出的光之后。偏振光的结合会产生轻微的偏移；这种转变将产生高对比度和高分辨率的 DIC 图像。 透射光显微镜的最新发展是 DPC——微分相差
DPC 的工作原理是可以从一对以相反照明角度拍摄的强度图像中提取相位梯度。利用DPC图像的数学算法，可以对微分相差图像进行定量相位重建方法。 （田 L. 和沃勒 L.，2015）。
DPC 不需要：
· 特定物镜（如相差物镜），
· 偏振光学（如 DIC），并且，
· 它可用于对双折射样本进行成像（Tian L. et al., 2014）。
此外，DPC 允许始终持续访问所有区域的样本（不依赖于 调整 角度或调整偏振器）。 与 DIC 不同，DPC 图像可以通过塑料培养皿获得，这很实用，而且对于许多生物成像应用来说通常是必不可少的。 即使在未染色的薄样品中，DPC 也能提供高对比度和高分辨率成像（影片 1）。
总之，DPC 是一种易于使用、廉价的透射光显微镜技术，可实现大照明角度并避免机械扫描的困难。对于透射光显微镜，DPC 结合了相衬和 DIC 成像技术的优点。因此，DPC是一种优秀的“无标记”成像方法，在活体样本成像中具有明显的应用前景。

2. 宽场荧光显微镜(Widefield Fluorescence Microscope)
宽场成像的特点是对样品进行充分照明并随后检测样品的所有发射光。实际上，在宽视场成像中，探测器将捕获聚焦光和聚焦外光(失焦光）。
以下步骤可以描述荧光现象：
· 分子（或分子系统）吸收特定波长（即激发波长）的光。
· 激发的电子将“跳跃”到原子轨道中的更高能级。
· 激发的电子将移回基能态并发射光子。
· 发射的光子将具有比激发光子更长的波长（更少的能量）。即发射波长
荧光是一种瞬时现象，一旦关闭激发光就不再存在。宽场荧光照明可以使用汞和氙气灯泡LED 光源以及最近的 基于激光的宽场照明来实现
**汞弧灯(Mercury Arc Lamp)**是第一个用于宽场荧光显微镜的光源。汞灯泡的优点之一是激发波长具有多个峰值，这些峰值与显微镜中使用的许多常见荧光团的激发波长（313、334、365、405、436、546 和 579 nm）一致。然而，整个光谱的照明并不均匀，使得定量分析样品变得困难。此外，红外和近红外荧光染料不被该光源激发。最后，汞是一种危险物质，如果可能的话最好避免使用。
与汞弧灯相比，氙弧灯 (Xenon Arc Lamp)在可见光谱范围内具有更均匀的照明，但其缺点是照明强度较低，并且在近紫外/紫外范围内的照明功率较低。这使得使用这种光源的常见 DNA 染色染料（例如 DAPI 和 Hoechst）具有挑战性，因为它们的发射很弱。此外，这些照明源（汞灯和氙弧灯）的使用寿命有限，如果频繁打开和关闭照明，使用寿命就会缩短。
LED 光源 已在荧光显微镜成像中确立了自己的地位。 LED 已发展成为一种高效照明光源，具有较长的使用寿命，并且其持续时间不受系统开关的影响。近年来，LED 光源变得流行并取代了曾经常见的水银和氙气光源。
 
3. 共聚焦显微镜(Confocal Microscope)
宽场荧光显微镜有其局限性， 在宽场显微镜中观察厚度大于 30 µm 的样品极其困难，如果样品厚度大于 50 µm，则几乎不可能。宽场荧光显微镜的问题是检测器捕获产生的离焦光，导致细节丢失。在这些情况下，解决方案是使用某种形式的光学切片将照明仅限于对焦区域。光学切片可以使用共焦显微镜来实现。
共焦显微镜通过使用一束或多束聚焦光束扫描样品来照明样品，并仅捕获来自正在成像的光学部分的聚焦光。共焦显微镜有两种不同类型： 激光扫描共焦显微镜 (LSCM) 和 转盘共焦显微镜。两种共焦成像系统都可以通过样品进行光学切片，但这两种类型的仪器背后的技术有根本的不同。 （点扫描仪和转盘显微镜照明模式的示意图。点扫描共焦显微镜 (a) 通过小孔径（针孔）聚焦单个激光点，并逐点顺序扫描样品。转盘共焦显微镜 (b ) 使用 1,000 个针孔的旋转图案来照明样品，以实现完全同步的共焦照明）
 
——LSCM激光扫描共焦显微镜 （也称为 Point Scanner Confocal 点扫描共焦显微镜）使用小点高强度激光扫描样品。使用物镜聚焦光斑，并沿着扫描区域横向移动以扫描样品。从发射的光来看，只有焦点对准的 Z 部分将穿过单个针孔，以创建光学部分（在该单个点上）。通过针孔后，发出的光被 **光电倍增管 (PMT)**检测到。生成的图像是扫描区域中扫描的所有单点的总和.
激光扫描共焦显微镜的局限性 包括所采集图像的 **动态范围和采集速度** （因为样品是逐点扫描的）。 PMT的量子效率为 45%，这意味着 100 个激发光子中，只有 45 个会转化为电子并作为信号被检测到，其余的将会丢失。由于采集速度慢且探测器的量子效率较低，激光扫描共焦系统不适合实时成像应用。
重要的是，由于点扫描仪的采集速度较慢，因此在对大样本进行成像时需要牺牲分辨率，这将提供低于奈奎斯特标准的分辨率的采集。
——转盘共焦显微镜， 也称为 Multipoint Confocal 多点共焦显微镜， 使用包含多个针孔的圆盘扫描样品。针孔盘高速旋转，并且只需不到完整的盘旋转即可传送图像。此外， 转盘共焦显微镜使用基于相机的探测器。相机基础探测器的量子效率  比光电倍增管 (PMT) 量子效率高出2 倍。实际上，为了在激光扫描显微镜中从图像中获得相同的信噪比，与使用基于摄像头的探测器的等效系统相比，需要使用 2 倍以上的激光功率来照明样品。请注意，增加样品照明中的激光功率将导致更多的样品漂白和光毒性。
总之，共焦系统有两种类型：
· 激光扫描共焦显微镜（或点扫描仪）
· 转盘共焦显微镜（或多点共焦）。
与宽场系统相比，激光扫描和转盘共焦均可提供光学切片，提高图像的信噪比，并允许更深入地成像到细胞和组织中。即获取得到深处信息。

“Out-of-focus light"（聚焦外光）是指在显微镜成像过程中，未聚焦在目标平面上的光线，即光线没有通过样品的焦点部分。这种光线可能来自于样品之外的区域或者样品内部的不同深度，它们在最终成像中会干扰目标区域的成像质量。
在荧光显微镜中，荧光标记的样品会发出荧光信号，但由于样品不是完全薄片状，因此在成像时可能存在来自样品深层的散射光，或者来自样品周围的散射光等，这些光线就属于聚焦外光。这些未聚焦的光线会降低图像的对比度和清晰度，导致成像质量下降。
在共聚焦显微镜中，通过调整光路和使用共聚焦技术，可以尽可能地消除聚焦外光，使得只有通过焦点的光线被收集和成像，从而获得高对比度、高分辨率的图像。共聚焦显微镜通过同时获取不同深度的光信号并进行叠加，可以消除来自样品深层的聚焦外光，提高成像的空间分辨率和清晰度。
因此，在荧光显微镜和共聚焦显微镜中，减少或消除聚焦外光对于获得高质量的成像结果至关重要。

 Reference:
Focal Plane - Overview of Microscopy Techniques: Confocal, Widefield, Transmitted Light and Deconvolution)