荧光知识科普

什么是荧光？

荧光现象是指分子在吸收光子后进入激发态，并随后通过发射光子返回基态的过程。能够进行此过程的分子被称为荧光团（fluorophore）。
通常，荧光过程中吸收的光子具有比发射的光子更高的能量，因此荧光团发射的光子的波长往往比吸收的光子更长。这种波长变化反映了能量从高到低的转移。
用于激发荧光团的光称为激发光（excitation light），而荧光团发射的光则被称为发射光（emission light）。激发光与发射光之间的波长差异被称为斯托克斯位移（Stokes shift），这是荧光光谱中的一个关键特征。
荧光现象发生得极为迅速。当荧光团吸收激发光子后，它会在极短的时间内进入激发态，并且通常只在该状态持续几纳秒。在此之后，荧光团通过发射光子回到基态。因此，一旦停止激发光，荧光团几乎立即停止发光。

荧光染料
荧光染料通常是由多个芳香环组成的有机分子，这类分子因为其复杂的结构可以吸收特定波长的光，称为激发光。吸收了激发光之后，染料分子的能量增加，进入激发态（S1'）。由于这种高能状态不稳定，分子通常通过旋转或振动等方式部分释放能量。然而，荧光染料的分子结构使得它们在释放一部分能量后，通过发射光子的方式回到基态，这一过程就产生了荧光。因为在发射光子前已经损失了一部分能量，荧光的波长比激发光要长，能量较低，这被称为光谱红移。例如，Alexa Fluor 594的激发波长为590nm，而发射波长则在617nm左右。

荧光染料只要保持其化学结构的完整性，可以在激发和发射光的循环中多次使用。这意味着一个染料分子能够多次发出荧光，除非其化学结构在激发态下发生不可逆的破坏，导致染料无法再发光，这种现象称为光漂白。荧光染料的发射效率可以维持在很高的水平，因此在许多实验中，染料的反复使用性能显著，能够确保灵敏度。例如，常见的生物实验中，染料的激发和发射峰值对实验条件非常敏感，溶剂环境的不同也会导致这些参数的变化。

Ex/Em与荧光光谱
荧光染料在吸收光能时，通常能够在一个特定波长范围内被激发，然而这个范围中的光强度并不是均匀的。在染料吸收光最强的波长位置，称为激发峰（Excitation Peak）。当染料被激发后，释放出荧光，其发出的光也分布在一个宽泛的波长范围内，其中光强度最强的波长称为发射峰（Emission Peak）。因此，当使用接近染料激发峰的光照射时，染料能够吸收最多的能量，从而产生最强的荧光；而在靠近发射峰的波长附近检测荧光信号时，通常能够获得最亮、最灵敏的信号。
每种荧光染料都有特定的激发和发射波长，简称为Ex/Em值。这些值在实验中起到关键作用，可以帮助研究人员选择合适的光源和检测器。然而，不同的溶剂环境（如水溶液与有机溶剂）会影响染料的光学特性，使得Ex/Em值有所偏移。此外，不同实验仪器的检测灵敏度和校准标准也可能导致测得的激发和发射波长出现细微的差异。

根据赛默飞官网工具SpectraViewer, 497-499nm均为100%激发值，通常我们会选用接近此值的LED(470)或激光(488nm)作为激发光源。虚实线分别为FITC激发与发射光谱曲线。

 

Stokes 位移
Stokes位移是指激发光谱与荧光发射光谱之间的峰值差异，这个差异是由于分子在吸收能量后部分能量以非辐射形式耗散掉。换句话说，染料分子在从激发态到基态的过程中，由于分子内能量的损失，发射出的光子能量较低，导致波长更长。因此，发射光的波长总是比激发光长。不同染料的Stokes位移差异较大，例如，Fluorescein的Stokes位移约为30nm，而一些近红外染料则可能达到100nm甚至更高。较小的Stokes位移意味着激发和发射光之间的波长差距较小，这可能导致实验中信号的干扰。

消光系数(Extinction Coefficient, ε)
是衡量荧光染料吸收光能力的参数，通常用于确定染料溶液的浓度。通过测量染料在特定激发波长下的吸光度，可以根据消光系数计算染料的浓度。消光系数越高，意味着染料吸收激发光的能力越强，从而能够发射出更多的荧光。消光系数是影响荧光染料亮度的关键因素之一，染料的亮度不仅与其吸收光的能力相关，还与其量子产率密切相关。

 

量子产率(Fluorescence Quantum Yield, Ф)
量子产率则描述了染料分子在吸收激发光后有多少能量转化为荧光。并不是所有吸收到的能量都会转化为发光，部分能量会通过振动或其他方式耗散掉。量子产率越高，表示染料的发光效率越高。不同染料的量子产率差异显著，例如，Rhodamine 6G的量子产率接近1.0，而某些红外染料的量子产率可能低至0.1甚至更低。

荧光淬灭(Fluorescence Quenching)
指由于染料分子之间距离过近或其他分子干扰，导致荧光信号减弱的现象。与光漂白不同，荧光淬灭是可逆的，分子间的距离一旦增大，荧光强度可以恢复。荧光淬灭现象通常出现在染料浓度过高或染料分子在标记大分子时过度聚集的情况下。因此，在进行荧光标记实验时，应合理控制染料的使用量，避免标记过多导致淬灭，从而影响实验结果。光漂白

 

光漂白(Fluorescence Bleaching)
指染料分子在高强度光照下发生的不可逆化学变化，导致其发光能力丧失。尽管大多数染料都会经历光漂白，但不同染料的耐光性差异较大。例如，某些高性能的染料如Atto 488经过特殊改造，可以显著延长其发光寿命，减少光漂白的影响。这些染料在长时间的荧光实验中表现出更高的稳定性，适用于复杂的成像或长时间追踪实验。

 

背景荧光（噪音）
是荧光实验中常见的一种干扰信号，指的是那些在图像中无意中出现的荧光，而不是研究者希望检测到的目标信号。背景荧光的来源广泛，其中最常见的包括样品未能彻底清洗掉非特异性结合的染料或其他杂质。这类情况通常可以通过优化洗涤步骤来有效解决。然而，更多时候，背景荧光是由样品本身固有的自发荧光引起的。

事实上，几乎所有的物质在光照射下都会发出一些微弱的荧光，这种自发荧光尤其在蓝光和绿光波段中表现得更加明显。随着波长的增加，背景荧光逐渐减弱，因此在受到背景干扰严重的实验中，通常推荐使用红色或近红外波段的荧光染料，以最大限度地减少干扰。此外，某些生物样品通过试剂预处理，也可以有效减少背景荧光的干扰，这有助于提高荧光信号的对比度和清晰度。

背景荧光的控制在某些精密实验中尤为重要。除了选择合适的荧光染料外，采用优化的实验条件和处理方法也能够显著降低背景干扰，提升实验结果的可靠性和准确性。